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反轉錄酶的新時代

特點一 具有高擴增活性,高熱穩定性的反轉錄酶

  反轉錄酶,又稱逆轉錄酶,是依賴RNA為模板的DNA聚合酶的統稱。美國科學家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年發現了反轉錄酶,并因此獲得了1975年的諾貝爾生理學醫學獎。反轉錄酶的發現對遺傳工程技術起來到了巨大的推動作用,是研究真核或者原核生物目的基因,構建cDNA文庫等實驗不可或缺的工具,與Taq酶等共同構成了現代生物技術的的基礎工具酶。

   目前已經商品化的反轉酶主要有,AMV(avian myeloblastosis virus)和m-mlv(molomey murine leukemia virus)兩種反轉錄酶。AMV來源于禽成髓細胞瘤病毒,最適反應溫度在42℃,具有較強的反轉錄活性和RNase-H活性, RNase H是一種核糖核酸內切酶,它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵,故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈,從而限制了cDNA的合成長度。 與之對應的m-mlv該酶基因來源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒,在具有較強的反轉錄活性的同時,卻具有較低的RNase-H活性,所以它可以獲得較長的cDNA片段。因此目前m-mlv應用最廣。

  但是這并沒有說明m-mlv就是完美的,由于的它的擴增能力有限,一般獲得的cDNA片段長度不超過6KB,不足以滿足構建cDNA片段,同時該酶的熱穩定性較差,50℃時半衰期很短,無法通過提高反應溫度克服RNA的二級結構,因此當遇到有復雜結構的RNA時,反轉錄酶就會從模板上掉下來,反轉錄失敗。如何通過基因工程的方法提高m-mlv的反轉錄活性,降低RNase-H活性,提高酶的熱穩定性,已成為生物公司的研發熱點之一。

  有著雄厚研發能力的北京百泰克生物技術有限公司,一直致力于優良性能的反轉錄酶的研發工作,在不懈的努力下終于在2011年年初迎來了突破性進展。我們經過對m-mlv基因多次定點突變,使該酶的性質得到了質的飛躍!消除了該酶的RNase-H活性,增加了反轉錄酶與模板的結合能力,增強了酶的延伸活性,從而很到程度上提高了酶的擴增速度,最大可以獲得超過15kb的cDNA片段,充分滿足了構建cDNA文庫的要求;不僅如此,我們研發的反轉錄酶耐熱性顯著增強,最適合反應溫度50℃,在42℃-55℃范圍內擁有最高活性的80%以上,最高反應溫度可達60℃,因此可以輕松克服模板RNA的二級結構,順利完成反轉錄實驗。其性能已經達到行業領先的水平,以下是我們公司與其他公司的反轉錄酶做的一些對照實驗:

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圖1 以小鼠總RNA為模板,反轉錄溫度42℃,PCR擴增基因為小鼠Cpt1a基因(1569-3567),a1、a2某知名公司m-mlv,b1、b2百泰克公司m-mlv supermo (200U,貨號PR6811),c1、c2百泰克公司m-mlv super III (200U,貨號PR6811),d1、d2某知名品牌產品

 


圖2以小鼠總RNA為模板,反轉錄溫度50℃,PCR擴增基因為小鼠Cpt1a基因(1569-3567),a1、a2百泰克公司supermo III (200U,貨號PR6811,b1、b2某知名公司產品,c1、c2某知名品牌產品


圖3以小鼠總RNA為模板,反轉錄溫度55℃,PCR擴增基因為小鼠Cpt1a基因(1569-3567),a1、a2某知名公司產品,b1、b2, 百泰克公司m-mlv supermo III (200U,貨號PR6811), c1、c2 某知名品牌產品


 
圖4以小鼠總RNA為模板,
以小鼠總RNA為模板,反轉錄溫度50℃,PCR擴增基因為小鼠Cpt1a基因(69-4042 ) ,a1、a2某知名公司產品, b1、b2, 百泰克公司m-mlv supermo III (200U,貨號PR6811)c1、c2某知名品牌產品

 

特點二 無細菌核酸污染的新型反轉錄酶

  常見的反轉錄酶主要有,AMV(avian myeloblastosis virus)和m-mlv(molomey murine leukemia virus),耐熱真菌分泌的翻轉酶等,市場上以前兩種反轉錄酶為主。目前這兩種商品化的反轉錄酶都是來源于大腸桿菌表達的重組酶,經過一定的純化方法后去除了大腸桿菌本身的雜蛋白后制得。雖然蛋白的純度較高,但是仍會有少量大腸桿菌的核酸污染,當RNA來自真核生物時,由于種系親緣關系很遠,反轉錄酶中污染的少量大腸桿菌一般不會影響擴增。但是當RNA來自原核生物尤其是腸桿菌屬時,由于親緣關系很近,此時反轉錄酶中污染的少量大腸桿菌核酸便會導致假陽性擴增,從而對正常的擴增產生致命的影響,很多研究原核RNA反轉錄和熒光定量的學者們深深地被這個問題困擾著,他們迫切希望能找到一種無大腸桿菌核酸污染的反轉酶。

  針對這樣的問題,有著雄厚研發能力的北京百泰克生物技術有限公司,經過反復試驗摸索,終于開發一套獨特的制備反轉酶的方法,采用該方法制備的反轉錄酶中不含有大腸桿菌自身的核酸片段,以此反轉錄酶為模板,用大腸桿菌16s DNA引物為進行PCR擴增,35個循環后熒光定量儀檢測無擴增。從而徹底解決了由于大腸桿菌核酸污染,導致實驗無法完成的難題。

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