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如何評判熒光定量試劑質量

熒光定量PCR試劑對比實驗結果(4月22日)

地點:中國農科院重大工程樓107

為檢驗BioTeke公司實時熒光定量試劑(SYBR GreenⅠ)質量,本次實驗分別采用國際知名的ABI公司(ABI Power SYBR Green PCR Master Mix)、TOYOBO公司(Realtime SYBR GreenⅠPCR Master Mix)和BioTeke公司產品進行實時熒光定量PCR分析,實驗過程中除了熒光定量試劑Mix不同,其它反應條件(模板、引物和反應體系等)均一致,所用熒光定量PCR儀型號為ABI7000。
實驗材料
小鼠肝臟組織
實驗方法
RNA提取:RNApure高純總RNA提取試劑盒(BioTeke),操作步驟參照說明書。目的基因:小鼠管家基因β–actin.。
cDNA制備:測定小鼠肝臟總RNA濃度,而后使用Super RT Kit(BioTeke) 制備20μl cDNA。操作參照試劑盒說明書。
二步法熒光定量PCR:
BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit. 20μl反應體系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl
ABI Power SYBR Green PCR Master Mix Kit 20μl反應體系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl
TOYOBO Realtime PCR Master Mix(SYBR Green) Kit 20μl反應體系:
2×SYBR premixture 10μl
RNA Free Water 8.2μl
Primer F 0.4μl
Primer R 0.4μl
cDNA 1μl

備注:每份試劑均做三管重復。

反應程序:
95℃ 10min
95℃ 15sec
61℃ 31sec
40個循環

實驗結果
小鼠肝臟組織RNA反轉錄成cDNA后分別用BioTeke公司試劑、ABI公司試劑和TOYOBO公司試劑同時進行兩步法熒光定量PCR擴增結果如圖1。

1

從三家公司試劑的擴增曲線(圖1a)可看出,在相同反應情況下BioTeke公司試劑的Ct值最小,TOYOBO公司的Ct值次之,ABI公司試劑的Ct值最大;另外,不同試劑的熒光信號值,BioTeke公司的最高,TOYOBO公司與ABI公司的大致相當,從這些結果可以說明,BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit具有較高的擴增效率。
從熔解曲線(圖1b)可以看出,ABI公司試劑和TOYOBO公司試劑與BioTeke公司相比熔解曲線峰值較低,也同樣反應出擴增效率高低的問題。另外兩家公司試劑的熔解曲線峰值重復性較差,反應特異性不好,建議引物重新設計。

實驗結論
經過實驗對比可看出BioTeke公司的2×SYBR real-time PCR premixture Kit是三家公司中擴增效率最高、特異性最好的,并且比ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix具有更高的擴增效率,更好的特異性。說明,BioTeke公司的試劑質量絕不亞于國際知名公司的產品。

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